DNS analīzes iespējas klīniskajā medicīnā

Dezoksiribonukleīnskābes (DNS) analīzes nozīme medicīnā tika izprasta jau drīz pēc DNS bioloģiskās lomas noskaidrošanas XX gs. vidū. Tomēr praktisku nozīmi DNS pētījumi ieguva 30 gadus vēlāk pēc efektīvu un salīdzinoši lētu DNS analīzes metožu izstrādāšanas. [1] Cilvēka DNS analīze mūsdienās tiek plaši veikta kā zinātniskiem nolūkiem (gēnu uzbūves, darbības un mijiedarbības pētījumi, populāciju ģenētiskie pētījumi u.tml.), tā arī praktiskiem mērķiem, tostarp tiesu medicīnā (indivīdu identifikācija, paternitātes un parentitātes noteikšana) un klīniskajā medicīnā. Ierobežotā apjoma dēļ rakstā apskatīta DNS analīze galvenokārt klīniskajā medicīnā.

DNS analīzes iespējas klīniskajā medicīnā jau šodien ir ļoti lielas, un tās strauji paplašinās. Pasaules medicīniskajā literatūrā ir pieņemts termins genomiskā medicīna, ar to saprotot medicīnu, kas ir bal­stīta uz cilvēka ģenētiskā materiāla kopuma - genoma (t.i. visas DNS) - izpētes datiem. [2;3] DNS analīze klīniskajā medicīnā var tikt lietota ne tikai slimību diagnostikai, bet arī prognozei, terapijai un profilaksei.

DNS analīze slimību diagnostikā

Uz DNS analīzi balstītu diagnostiku sauc par DNS diagnostiku, un tā ir pielietojama visās cilvēka ontoģenēzes stadijās: pirms dīgļa implantēšanās dzemdes sienā, prenatāli un postnatāli. Atklājot pārmaiņas ģenētiskajā materiālā, patoloģiju izdodas konstatēt vēl pirms klīnisko simptomu parādīšanās, tā radot iespēju agrīnas vai preventīvas terapijas uzsākšanai. DNS analīžu rezultātus neiespaido klīnisko izpausmju vai tradicionālo laboratorisko izmeklējumu datu variabilitāte.

Ar DNS izmeklējumu palīdzību diagnosticējamo patoloģiju loks ir plašs. Tās ir ne tikai monogēnās slimības, kuru attīstību nosaka pārmaiņas kādā vienā gēnā (piemēram, hemofilija, hereditāra hemohromatoze, mukoviscidoze jeb cistiskā fibroze, fenilketonūrija) [4], bet arī slimības, kuru iemesls ir mutācijas mitohondriālajā DNS vai arī ar parastajām mikroskopēšanas metodēm neatklājami hromosomu defekti. Aizvien biežāk DNS analīze tiek izmantota, lai atklātu tos bieži sastopamo slimību gadījumus, kad pacients ir mantojis iedzimtu predisponētību slimībai. Šo slimību attīstība, kas parasti ir atkarīga no pārmaiņām vairākos gēnos un nelabvēlīgiem vides apstākļiem, ir daudz vairāk iespējama, ja cilvēks jau ir piedzimis ar mutāciju kādā no konkrētas slimības riska gēniem. Tā, piemēram, iedzimta predisponētība ir konstatējama vidēji 5-10% ļaundabīgo audzēju gadījumu. Infekciozo aģentu DNS analīze palīdz infekciju slimību diagnostikā, t.sk. agrīnā.

Klīnisku gadījumu apraksti

  • 35 gadus vecam pacientam ar ilgstošiem dispeptiskiem traucējumiem konstatēta hepatomegālija un hronisks pankreatīts. Diagnozes precizēšanai pacients stacionēts Latvijas ­Infektoloģijas centra hronisko aknu slimību nodaļā. Aknu punkcijas biopsijā konstatēts liels skaits siderosomu aknu šūnās, radot aizdomas par dzelzs metabolisma defektu. Papildu izmeklējumos atklāts ievērojami paaugstināts feritīna līmenis serumā, kam var būt daudzi iemesli, un tāpēc pacienta asinis nosūtītas uz Rīgas Stradiņa universitātes Cilvēka molekulārās ģenētikas laboratoriju hereditārās hemohromatozes diagnozes apstiprināšanai. DNS analīzē konstatēts, ka pacientam dzelzs metabolisma regulācijā iesaistītajā gēnā HFE ir mutācija C282Y homozigotiskā stāvoklī (mutācija abās gēna kopijās). Šādu genotipu atrod 93-100% Ziemeļeiropas izcelsmes hereditārās hemohromatozes slimnieku. Pēc diagnozes apstiprināšanas pacientam sekmīgi uzsākta terapija ar regulāru hemoeksfūziju. Ģenētiskai konsultēšanai, t.sk. informācijai par saslimšanas risku radiniekiem, pacients nosūtīts uz Bērnu Klīniskās universitātes slimnīcas Medicīniskās ģenētikas klīniku (BKUS MĢK). Aprakstītajā gadījumā DNS analīze ļāva atklāt slimību vēl pirms neatgriezeniskas daudzorgānu patoloģijas rašanās.
  • BKUS Medicīniskās ģenētikas klīnikā konsultēts laulāts pāris, kuru ģimenē aug ar cistisko fibrozi (CF) slims dēls. Sieviete gaida otru bērnu un vēlas zināt, vai arī šim bērnam būs cistiskā fibroze. RSU Cilvēka molekulārās ģenētikas laboratorijā visiem ģimenes locekļiem tika veikta DNS analīze, meklējot mutācijas gēnā CFTR, kas ir bojāts CF gadījumā. Slimajam bērnam tika atrasta viena no divām viņa slimību izraisošām gēna CFTR mutācijām: mutācija dF508. Šī mutācija tika atrasta arī auglim. Otru mutāciju slimajam bērnam neizdevās atrast. Tāpēc, lai pārbaudītu, vai auglis ir mantojis arī otru slimību nesošo gēnu, ģimenei tika veikta netiešā DNS diagnostika. Tās rezultāti nebija iepriecinoši - auglis no vecākiem bija mantojis to pašu hromosomu kombināciju, ko pirmais bērns, tādējādi mantojot arī CF. Vecāki tika informēti par analīzes rezultātiem un reproduktīvās izvēles iespējām. Zinot, ka bērns būs slims, vecāku lēmums bija tomēr saglabāt grūtniecību. Ņemot vērā prenatālās diagnostikas rezultātus, bērnam tūlīt pēc dzimšanas tika uzsākta terapija, kuras mērķis bija panākt pēc iespējas maigāku CF klīnisko izpausmi.
  • Negatīvs piemērs: jauniem vecākiem piedzimis bērns ar smagu iedzimtu sirdskaiti un muskuļu vājumu. Pēc ģenētiķa konsultācijas izteiktas aizdomas, ka bērnam varētu būt miotoniskā distrofija. Šai slimībai ir raksturīga klīniska variabilitāte, progresējoša gaita un anticipācija (paaudžu gaitā slimība izpaužas smagāk, sākas agrāk). Iespējams, ka vienam no slimā bērna pašreiz vēl klīniski veseliem vecākiem ir mutācija miotonisko distrofiju izraisošajā gēnā DMPK. Tādā gadījumā varbūtība, ka nākamais bērns šajā ģimenē būs slims, ir 50%. Diagnozes apstiprināšanai, kā arī prenatālai patoloģijas konstatēšanai ir nepieciešama gēna DMPK DNS analīze, ko Latvijā ierobežota finansējuma dēļ neveic.

DNS analīze slimību prognostikā, terapijā un profilaksē

Cilvēka genoma pētījumi ir parādījuši, ka jebkuru divu indivīdu DNS 99,9% ir identiskas. [5;6] Atšķiras tikai 0,1% no mūsu DNS. Šīs atšķirības arī ir tās, kas nosaka cilvēku dažādu reakciju uz vides ap­stākļiem, t.sk. medikamentiem, kā arī atšķirīgu slimību gaitu. Viens no genomiskās medicīnas mērķiem ir radīt individualizētu, uz zināšanām par konkrēta cilvēka genomu balstītu medicīnu. Tiek likti pamati individualizētai terapijai ar devīzi pareizas zāles pareizā devā pareizam cilvēkam.Cilvēka DNS analīzi veicošas laboratorijas Latvijā (informācija par  DNS analīzes iespējām pieejama norādītajās interneta mājaslapās)

DNS analīzes dati var būt nozīmīgi slimību profilaksei, pēcnācēju prognozei. Zinot par noteiktu slimību riska gēnu klātbūtni savā genomā, cilvēks var mainīt savu dzīves stilu, ēšanas paradumus, ārstu apmeklējumu biežumu.

Klīniska gadījuma apraksts

Jauna sieviete, kuras māte 47 gadu vecumā mirusi ar krūts vēzi, izlasījusi laikrak­stā par Latvijā veiktiem ļaundabīgo audzēju molekulāri-ģenētiskiem pētījumiem, lūgusi Biomedicīnas studiju un pētījumu centra (BMC) speciālistiem veikt viņai DNS analīzi (BMC ir tā institūcija, kur veic apjomīgākos molekulāri-bioloģiskos pētījumus Latvijā; tur tiek veidota arī Latvijas iedzīvotāju genoma datu bāze). Pēc konsultācijas ar onkologiem sievietei izdarīta krūts vēža izcel­smē visbiežāk iesaistītā gēna BRCA1 analīze un atklāta viena no trim biežākajām Latvijā sastopamajām šī gēna mutācijām. [7] Latvijas Onkoloģijas centrā viņai izskaidroti analīzes rezultāti: risks saslimt ar krūts vēzi dzīves laikā ir 56-87%, ar olnīcu vēzi - 16-44%, varbūtība mutāciju nodot bērniem - 50%. Rekomendēts nelietot orālās kontracepcijas līdzekļus, veikt regulārus krūšu izmeklējumus (pašizmeklēšanu, konsultācijas pie ārsta-speciālista, ultrasonoskopiju, mammogrāfiju, kodolmagnētisko rezonansi) un olnīcu izmeklējumus. Sieviete informēta par iespēju veikt profilaktisku ovarektomiju un/vai mastektomiju ar sekojošu krūšu rekonstrukciju.

DNS izdalīšana un uzglabāšana

DNS analīzi var veikt jebkuram audu paraugam, ir nepieciešamas tikai kodolu saturošas šūnas. Šūnu daudzums, kas nepieciešams turpmākai analīzei, variē atkarībā no pielietojuma veida. Diagnostiskajās laboratorijās visbiežāk izmanto asins leikocītus un mutes gļotādas šūnas, dažreiz kaulu smadzenes. Rutīnai DNS diagnostikai vislabāk izmantojamas ir venozās asinis (2-4 ml), kas nodrošina iespēju neveiksmīga testa rezultātā pārbaudi atkārtot. Tiesu medicīnā cilvēka identifikācijai izmanto plašāku audu klāstu: asins, sviedru, siekalu un spermas traipus, matus, kaulu fragmentus.

Lai gan DNS ir salīdzinoši stabila struktūra, tomēr paraugu vislabāk uglabāt +4°C temperatūrā. Paraugus ieteicams izmantot dažu dienu laikā. Ilgākai glabāšanai asins paraugus var sasaldēt. Istabas temperatūrā DNS fragmentējas, un tas apgrūtina diagnostiku, kā arī var ietekmēt gala rezultātu.

Prenatālā diagnostika

Prenatālai diagnostikai visbiežāk izmanto nekultivētus/kultivētus amniocītus un horija bārkstiņu šūnas. Horija bārkstiņu biopsijas priekšrocības ir iespēja paņemt audu paraugu jau no 11.grūtniecības nedēļas, trūkums - par 2% paaugstināts spontānā aborta risks. Amniocentēzi rekomendē veikt no 15.grūtniecības nedēļas (spontānā aborta papildus risks - 1%). Rutīnas DNS analīzes veikšanai nepieciešamais laiks parasti ir 14-21 diena.

Bērna dzimuma prenatāla noteikšana, izmantojot DNS analīzi, ir iespējama, bet Latvijā, tāpat kā lielākajā daļā valstu, ētisku apsvērumu dēļ nav rekomendējama. Izņēmums ir to slimību, kuras izpaužas tikai vienam dzimumam, gadījumi, kad patoloģijas prenatāla diagnostika nav iespējama.

Ģenētiskas patoloģijas prenatālai diagnostikai varētu izmantot arī augļa šūnas, ko grūtniecības laikā var atrast sievietes perifērajās asinīs. Šī metode būtu lieliska alternatīva invazīvajām metodēm (amniocentēzei un horija bārkstiņu biopsijai), jo spontāna aborta risks būtu samazināts līdz minimumam. Diemžēl šobrīd minētā metode joprojām ir eksperimentālā līmenī un diagnostisko laboratoriju praksē nav ieviesta, jo ir darbietilpīga un grūti izmantojama rutīnas diagnostikai. Lielākās grūtības rada augļa šūnu atdalīšana no mātes asins šūnām, jo ir iespējami viltus pozitīvi rezultāti.

Preimplantācijas diagnostika

Preimplantācijas diagnostikas gadījumā, kas Latvijā vēl nav pieejama, DNS analīzi veic pēc in vitro apaugļošanas, paņemot vienu divas šūnas no sešiem līdz astoņiem blastomēriem, kas izveidojušies, daloties zigotai. Ja pārbaudāmajā materiālā patoloģiju neidentificē, pārējās šūnas implantē dzemdē.

DNS analīzes metodoloģija

Pirms vairākiem desmitiem gadu vienas DNS analīzes izmaksas bija mērāmas simtos latu un bija tikai atsevišķi pētniecības institūti un centri, kur veica šīs analīzes.

Apvērsumu DNS diagnostikā radīja polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR - polymerase chain reaction) ieviešana, kas izmanto termostabilu DNS polimerāzi, lai pavairotu analizējamo DNS reģionu līdz pat miljoniem reižu. Metodes ērtais un vieglais pielietojums padarīja DNS analīzi pieejamu jebkurā laboratorijā.

No 1970.gada līdz mūsdienām daudzus uzlabojumus un automatizāciju ir piedzīvojusi DNS nukleotīdu secības atšifrēšanas metode - DNS sekvencēšana. Īpašā aparatūrā elektriskajā laukā pa tieviem kapilāriem pēc PCR migrē dažāda garuma DNS fragmenti, kuru pēdējais nukleotīds ir iezīmēts ar kādu fluorohromu. Rezultātu nolasa lāzers.Gēna GJB2 mutācijas 35delG  noteikšana, analizējot DNS fragmentu  garumu 6% poliakrilamīda gelā

DNS analīzes ilustrācijai 1. un 2. attēlā ir parādīta mutācijas 35delG noteikšana gēnā GJB2 (BKUS Medicīniskās ģenētikas klīnikas kolekcija, O.Oļhovajas dati) ar minētajām metodēm. Šī mutācija - 35. nukleotīda - guanīna delēcija (izkrišana) - homozigotiskā formā ir biežākais bērnu iedzimtas sensoneirālas vājdzirdības iemesls.Gēna GJB2 mutācijas 35delG noteikšana ar DNS sekvenēšanas metodi

Perspektīvas

Zinātnieki, identificējot gēnus, izstrādā metodes šo gēnu biežāko mutāciju DNS diagnostikai. Biežām pārmantotām slimībām nereti ir raksturīga nevis viena vai divas mutācijas, bet katrā populācijā īpašs mutāciju sastāvs. Ideālā gadījumā katrā valstī zinātnieki, analizējot biežākās ģenētiskās slimības, atrod mutācijas, kas raksturīgas konkrētai populācijai un attīsta DNS diagnostiku, balstoties uz savu pētījumu rezultātiem. Lai atpelnītu pētījumos ieguldītos līdzekļus, tiek izveidoti un piedāvāti tirgū jau gatavi DNS diagnostikas komplekti. Patērētājiem ir iespēja izvēlēties pirkt gatavu diagnostikas komplektu, kas, piemēram, noteiktā populācijā atrod līdz 60-75% mutāciju analizējamā gēnā, vai pašiem veikt pētījumus un izstrādāt konkrētai populācijai piemērotas DNS analīzes metodes.

Iespējams, molekulārās ģenētikas nākotne ir vairāku ģenētisko patoloģiju diagnostika vienā stobriņā. Šodien DNS analīze tiek izmantota galvenokārt monogēno slimību diagnostikā, tomēr šo slimību incidence nav tik liela kā biežāk sastopamām slimībām: cukura diabētam, koronārai sirds slimībai u.c., kuru riska gēnu lielākā daļa vēl nav zināma. Atklājot bieži sastopamo slimību galvenos riska gēnus, izmantojot čipu tehnoloģiju, varēs veikt presimptomātisku diagnostiku vienlaikus lielākam slimību skaitam.

Kopsavilkums

DNS analīze ir ievērojami ­paplašinājusi medicīnas iespējas un padarījusi par ikdienu mērķus, kuri agrāk šķita nesasniedzami. Runājot par DNS analīzes nepieciešamību, vairāk gribētos diskutēt par problēmām, ko rada tās nepietiekamā izmantošana. Pārmantotu slimību gadījumā ir izstrādātas diagnostikas metodes, kas ļauj apstiprināt pacientu diagnozi. Izvairoties no šo DNS diagnostikas metožu ieviešanas, jāuzņemas atbildība par iespējami nepareizas diagnozes uzstādīšanu, kam seko nepareiza terapija, kā arī par risku, ka neprecizētas slimības gadījumā piedzims bērns ar šo slimību, turklāt dažos gadījumos ar vēl smagāku tās formu un agrāku izpausmi.

Genoma pētījumu pārsteidzošo rezultātu ieviešana klīniskajā praksē nav iespējama bez plašas mediķu līdzdalības. Ārsti ir tie, kam jāzina, kādos gadījumos ir nepieciešamas DNS analīzes (ne vienmēr un ne visas no piedāvātajām analīzēm ir nepieciešamas), un vai tās Latvijā ir pieejamas. Centri (laboratorijas), kur Latvijā saistībā ar klīnisko medicīnu tiek analizēta cilvēka DNS, apkopoti tabulā. Ar ģimenes ārsta nosūtījumu ģenētiķa konsultācija BKUS MĢK ir bezmaksas. Onkoloģisku un kardioloģisku slimību farmakoģenētiski pētījumi Latvijā tiek veikti Biomedicīnas pētījumu un studiju centrā. Ārstiem par DNS analīzes iespēju ir jāinformē slimnieki, nepieciešamības gadījumā pacientu nosūtot uz ģenētisko konsultāciju.

Literatūra

  1. Turnpenny P.D., Ellard S. Emery's elements of medical genetics 12th ed.//Elsevier; Churchill Livingstone, 2005.
  2. Guttmacher A.E., Collins F.S. Genomic medicine - a primer//N Engl J Med, 2002, 347: 1512-1520.
  3. Epstein C. J. Medical genetics in the genomic medicine of the 21st century//Amer J Hum Gen, 2006, 79: 434-438.
  4. McKusick V.A. Mendelian inheritance in man: catalogs of human genes and genetic disorders. 12th ed.//Baltimore: Johns Hopkins University Press, 1998.
  5. International Human Genome Sequencing Consortium.Initial sequencing and analysis of the human genome//Nature, 2001, 409: 860-921.
  6. Venter J.C., Adams M.D., Myers E.W. et al.The sequence of the human genome//Science, 2001, 291: 1304-1351.
  7. Eglītis J., Stengrevics A., Tihomirova L. Krūts vēža ģe­­nētiskie aspekti//Latvijas Ārsts, Nov 2002, 17-21.

 

Uz augšu ↑
  • Iekaisīgu zarnu slimību ārpuszarnu izpausmes. II daļa*

    Lai gan iekaisīgu zarnu slimību (IZS) izplatības rādītājs Latvijā ir zems, pacientu skaits pakāpeniski pieaug. Paula Stradiņa KUS statistikas dati rāda stacionēto Krona slimības (KS) pacientu skaita pieaugumu 18—44 gadu vecumā, čūlainā kolīta (ČK) gadījumā pēc 60 gadu vecuma. Šajā Doctus numurā par IZS izpausmēm ārpus zarnām balsta—kustību aparātā, ādā, sirdī, acīs, uroģenitālajā sistēmā, CNS. Lasīt visu

  • Tetovējumi. Riski un komplikācijas

    Termins “tetovēšana” radies no taitiešu vārda “tattau”, un process apzīmē permanentu jeb paliekošu pigmenta granulu ievadīšanu ādā. [10] Tetovēšana izsenis izmantota reliģiskiem, estētiskiem, sociāliem un kulturāliem mērķiem, [20] mūsdienās tie kļuvuši par popkultūras fenomenu — pētījumos ASV vismaz viens tetovējums ir 24 % respondentu, [24] Eiropā vidēji 12 % no populācijas. [33] Lasīt visu

  • Parkinsona slimība. Izcelsme, diagnostika, ārstēšanas principi

    Idiopātiska Parkinsona slimība (PS) ir otra biežāk sastopamā neirodeģeneratīvā slimība pēc Alcheimera slimības. [1—4] Tā skar 2—3 % populācijas vecumgrupā pēc 65 gadiem. [1; 2] Slimībai raksturīgs pakāpeniski progresējošs kustību nespējas pieaugums ar motorisko un nemotorisko simptomu (NMS) attīstību. [5] Lasīt visu